Esta técnica ha demostrado ser una excelente herramienta para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos. Entre las numerosas aplicaciones desarrolladas figuran los estudios de cuantificación absoluta o relativa de perfiles transcripcionales, medida de número de copias de un gen en DNAs genómicos o virales, estudios de discriminación alélica (SNPs), ensayos de detección e identificación de patógenos y de OMGs, etc.

Las estrategias de marcaje utilizadas se basan en sondas Taqman o SYBR Green. La detección de la fluorescencia en el equipo ABI PRISM 7000 se realiza mediante filtros de emisión optimizados para el uso de los fluoróforos FAM™/SYBR® Green 1, VIC™/JOE, NED™/TAMRA™ y ROX™.

El sistema de calentamiento, basado en "Peltier", es compatible con placas estandard de 96 pocillos o con tubos eppendorf de 0,2 ml.

El diseño de los cebadores y sondas está asistido mediante el software Primer Express v2.0 (Applied Biosystems), y el diseño del experimento y tratamiento de los resultados obtenidos mediante el software Sequence Detection Software v1.2.3 (Applied Biosystems), ambos a disposición de los usuarios del Servicio.

MODALIDADES
Autoanálisis

• Se entregan las reacciones de secuenciación ya preparadas para su análisis por electroforesis.
• Se recomienda utilizar el kit de Applied Biosystems Sanger Sequencing Kit (Applied Biosystems), que incluye el reactivo ExoSAP-IT Express, para limpiar los productos de PCR, el BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, para llevar a cabo la reacción de secuenciación, y el BigDye XTerminator Purification Kit para la eliminación de terminadores. De forma alternativa, se pueden eliminar terminadores mediante precipitación con etanol.
• El usuario adjuntará a la solicitud, una hoja Excel (envío muestras secuenciación) con el diseño de la placa, en el que se incluyan los nombres de las muestras y el orden en el que desea cargarlas.

Secuenciación completa

• El usuario entregará 20 µL de DNA plasmídico (resuspendido en agua estéril) o 20 µL de producto de PCR, indicando concentración y método empleado para medirla. Siempre que sea posible, se adjuntará una foto del material y de un marcador de pesos moleculares en un gel de agarosa.
• La concentración cuantificada mínima exigida es de 100 ng/µL para DNA plasmídico y de 50 ng/µL para producto de PCR.
• El Servicio se encargará de realizar la reacción de secuenciación, la eliminación de terminadores y la electroforesis. También puede hacerse cargo de la purificación del material de PCR siempre que así lo indique el usuario en la solicitud.
• El éxito de la secuenciación está íntimamente relacionado con la calidad y pureza del DNA, pudiendo también influir la cepa bacteriana, el vector de clonación y la naturaleza del fragmento a secuenciar. Ante esto, el DNA plasmídico entregado deberá estar libre de RNA, proteínas y sales, y el producto de PCR deberá estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interfieren en la reacción de secuenciación. Para su purificación se recomienda usar ExoSAP-IT Express (Applied Biosystems).
• El usuario rellenará una hoja Excel (envío muestras secuenciación) donde indicará claramente el nombre de la muestra, el vector de clonación y el tamaño del inserto, o el tamaño del producto de PCR y el programa térmico utilizado para su amplificación, y nombre, secuencia y Tm de los cebadores a emplear. La hoja se adjuntará en el momento de hacer la solicitud.
• El Servicio dispone de los siguientes cebadores:

  M13 directo (-40):	5’GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG TA 3’
  M13 directo (-27):	5’CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
  M13 directo (-21):	5’TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
  M13 reverso (-29):	5’CAG GAA ACA GCT ATG ACC 3’
  M13 reverso (-27):	5’GGA AAC AGC TAT GAC CAT 3’
  Sp6:	5’GAT TTA GGT GAC ACT ATA G 3’
  BGH reverso:	5’TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3’
  T7 directo:	5’GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT 3’
  T7 reverso:	5’GCT AGT TAT TGC TCA GCG GTG 3’

• Se puede utilizar cualquier otro cebador sintetizado por el usuario siempre que cumpla los siguientes requisitos:
  • Longitud: 16-22 nucleótidos
  • % GC: 40-50%
  • Tm: 50-65º C.
• El usuario debe proporcionar un volumen mínimo de 10 µL del cebador de concentración 10 µM por reacción.

La Secuenciación masiva incluye las siguientes aplicaciones:

• Resecuenciación del genoma completo
• Resecuenciación selectiva
• Secuenciación de novo de genoma pequeño (vírico o bacteriano)
• Secuenciación de ARNmensajero y ARNpequeño
• Secuenciación de Transcriptoma dirigido
• Secuenciación de Transcriptoma completo
• Secuenciación de Exoma
• Secuenciación de ADN modificado con bisulfito para estudios de perfiles de metilación
• Secuenciación ChIP-Seq para estudios de interacciones DNA-proteína y RNA-proteína
• Secuenciación CNV-Seq para medición de la variación del número de copia
• Metagenómica (secuenciación de ARNr 16S)

Con el Secuenciador Automático ADN 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) se pueden utilizar hasta 5 marcadores fluorescentes simultáneamente: 6-FAM, VIC, NED, PET y LIZ , este último reservado para el marcador de tamaños moleculares, y combinar diferentes tamaños alélicos en la misma muestra, por lo que por cada capilar en una sola electroforesis se pueden analizar multitud de fragmentos.

MODALIDADES
Autoanálisis

• Dada la especificidad de la técnica, el Servicio se hará cargo únicamente de la etapa final, es decir, de la separación y análisis de los fragmentos mediante electroforesis.
• En algunos casos puede ser necesario un paso de purificación de los fragmentos (ExoSAP-IT Express (Applied Biosystems) o precipitación con etanol) antes del proceso de electroforesis.
• Para la determinación de los tamaños el Servicio dispone de los marcadores de pesos moleculares GeneScan 600LIZ, con un total de 36 fragmentos marcados en un rango de 20-600 pb y el GeneScan 1200LIZ, con un total de 68 fragmentos marcados en un rango de 20-1200 pb, si bien puede usarse cualquier otro marcador de tamaño marcado con LIZ de Applied Biosystems o aportado por el usuario.
• En el momento de hacer la solicitud, el usuario adjuntará una hoja Excel (envío muestras genotipado) con el diseño de la placa en el que se incluyan los nombres de las muestras, el orden en el que desea cargarlas y la descripción de los distintos polimorfismos que se van a analizar.

El análisis de polimorfismos de un sólo nucleótido (SNPs) se basa en el uso de cebadores específicos que terminan justo antes de la base a determinar. Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos, marcados cada uno con un fluoróforo diferente. La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo. El Secuenciador Automático ADN 3500XL Genetic Analyzer, permite analizar hasta 10 SNPs por inyección.

El empleo del marcador de tamaños GeneScan 120LIZ, con un total de 9 fragmentos marcados en un rango de 15-120 pb, permite trabajar con fragmentos incluidos en ese rango de tamaños y marcados con los fluoróforos FAM, VIC, NED o PET.

MODALIDADES
Autoanálisis

• Se entregan las reacciones de SNaPshot ya preparadas para su análisis por electroforesis.
• Se recomienda utilizar el kit ABIPrism SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems), con eliminación de terminadores mediante purificación con SAP(Applied Biosystems).
• El usuario adjuntará a la solicitud una hoja excel con el diseño de la placa en el que se incluyan los nombres de las muestras, el orden en el que desea cargarlas y la descripción de los distintos polimorfismos que se van a analizar.

Análisis completo

• El usuario entregará 10 µL de producto de PCR cuantificado y resuspendido en agua estéril, junto con su foto en un gel de agarosa.
• La concentración cuantificada mínima exigida es 50 ng/µL.
• El Servicio se encargará de realizar la reacción de SNaPshot, la eliminación de terminadores y la electroforesis.
• El producto de PCR deberá tener una longitud mínima de 350 pb y estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interfieren en la reacción de SNaPshot. Para su purificación se recomienda usar ExoSAP-IT Express (Applied Biosystems).
• El usuario indicará claramente el nombre de la muestra, el tamaño del producto de PCR y el programa térmico utilizado para su amplificación.
• El usuario debe de proporcionar un volumen mínimo de 5 µL de la sonda de concentración 2 µM por reacción, junto con el nombre, la secuencia y la Tm de la misma, además de la descripción completa del correspondiente polimorfismo.
• Las sondas deben cumplir los siguientes requisitos:
  • Haber sido purificadas mediante HPLC.
  • Tener una longitud comprendida entre 18 y 25 nucleótidos.
  • Acabar justo antes del polimorfismo correspondiente.
  • No formar estructuras secundarias (las 3 últimas bases del extremo 3' no deben ser complementarias a ninguna otra región del cebador).
  • Evitar el uso del desoxinucleótido G en posición 3' terminal.

En general, la contaminación cruzada y el error en la identificación de líneas celulares se estima que es del orden del 15-20%. Este es un problema serio para la interpretación correcta de los datos derivados del trabajo con células, ya que en realidad no se trabaja con las líneas supuestas. Trabajar con materiales bien identificados, autentificando las líneas celulares mediante la nueva técnica ofertada, evita pérdida de tiempo y dinero, resultados no reproducibles y pérdida de credibilidad.

Las directrices y recomendaciones de los expertos apuntan que la mejor manera de identificar las líneas celulares es obtener un perfil de alelos de STRs (Short Tandem Repeats) para cada línea celular, que se compara con bases de datos bien establecidas (CLIMA 2.1) para encontrar las concordancias con líneas celulares estudiadas.

Sobre el DNA obtenido de la muestra del cultivo celular se realiza una PCR multiplex, con el kit GenePrint 10 de Promega, para amplificar las regiones de los STRs (D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, VWA, TH01, Amelogenina, TPOX, CSF1PO, D21S11). Los amplicones generados se corren en un secuenciador capilar ABI Prism 3500XL Genetic Analyzer y la identificación del tamaño de los fragmentos de cada locus se realiza con el software GeneMapper v.4.1 (Applied Biosystems).