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Análisis de SNPsVolver

El análisis de polimorfismos de un sólo nucleótido (SNPs) se basa en el uso de cebadores específicos que terminan justo antes de la base a determinar. Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos, marcados cada uno con un fluoróforo diferente. La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo.
Con el Secuenciador Automático MegaBACE500 (GE Healthcare) se pueden analizar varios SNPs en el mismo capilar ya que el sistema permite la inyección consecutiva de varias reacciones, utilizando para ello un marcador de inyección.

MODALIDADES
  • Autoanálisis y autoanálisis sin material de carga

    • Se entregan las reacciones de SNuPe ya preparadas para su análisis por electroforesis, con o sin la placa de carga, la matriz y el buffer, respectivamente según la modalidad elegida.

    • Se recomienda utilizar el kit MegaBace SNuPe genotyping kit(GE Healthcare), con eliminación de terminadores mediante purificación con SAP(GE Healthcare).

    • El usuario entregará junto con las muestras, una hoja excel con el diseño de la placa en el que se incluyan los nombres de las muestras y el orden en el que desea cargarlas, el número de inyecciones que se van a realizar y la descripción de los distintos polimorfismos que se van a analizar.

  • Análisis completo

    • El usuario entregará 10 µL de producto de PCR cuantificado y resuspendido en agua estéril, junto con su foto en un gel de agarosa.

    • La concentración cuantificada mínima exigida es 50 ng/µL.

    • El Servicio se encargará de realizar la reacción de SNuPe, la eliminación de terminadores y la electroforesis.

    • El producto de PCR deberá tener una longitud mínima de 350 pb y estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interfieren en la reacción de SNuPe. Para su purificación se recomienda usar ExoSAP-IT(GE Healthcare).

    • El usuario indicará claramente el nombre de la muestra, el tamaño del producto de PCR y el programa térmico utilizado para su amplificación.

    • El usuario debe de proporcionar un volumen mínimo de 5 µL de la sonda de concentración 2 µM por reacción, junto con el nombre, la secuencia y la Tm de la misma, además de la descripción completa del correspondiente polimorfismo.

    • Las sondas deben cumplir los siguientes requisitos:

      • Haber sido purificadas mediante HPLC.
      • Tener una longitud comprendida entre 18 y 25 nucleótidos.
      • Acabar justo antes del polimorfismo correspondiente.
      • No formar estructuras secundarias (las 3 últimas bases del extremo 3' no deben ser complementarias a ninguna otra región del cebador).
      • Evitar el uso del desoxinucleótido G en posición 3' terminal.


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