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decorativodecorativoSERVICIO DE SECUENCIACIÓN Y GENÓMICA FUNCIONALdecorativo
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UZ+IACS 
Cartera de Servicios

Secuenciación capilar de ADNVolver

MODALIDADES
  • Autosecuenciación y autosecuenciación sin material de carga

    • Se entregan las reacciones de secuenciación ya preparadas para su análisis por electroforesis, con o sin la placa de carga, la matriz y el buffer, respectivamente según la modalidad elegida.

    • Se recomienda utilizar el kit MegaBACE DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare), con eliminación de terminadores mediante precipitación con etanol o mediante el kit AutoSeq 96 Dye Terminator Clean-up (GE Healthcare).

    • El usuario entregará junto con las muestras, una hoja Excel (Envio Muestras Secuenciación) con el diseño de la placa, en el que se incluyan los nombres de las muestras y el orden en el que desea cargarlas.

  • Secuenciación completa

    • El usuario entregará 20 µL de DNA plasmídico o producto de PCR cuantificado y resuspendido en agua estéril, junto con una foto del material y de un marcador de pesos moleculares en un gel de agarosa.

    • La concentración cuantificada mínima exigida es de 100 ng/µL para DNA plasmídico y de 50 ng/µL para producto de PCR.

    • El Servicio se encargará de realizar la reacción de secuenciación, la eliminación de terminadores y la electroforesis.

    • El éxito de la secuenciación está íntimamente relacionado con la calidad y pureza del DNA, pudiendo también influir la cepa bacteriana, el vector de clonación y la naturaleza del fragmento a secuenciar. Ante esto, el DNA plasmídico entregado deberá estar libre de RNA, proteínas y sales, y el producto de PCR deberá estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interfieren en la reacción de secuenciación. Para su purificación se recomienda usar ExoSAP-IT(GE Healthcare).

    • El usuario rellenará una hoja Excel (Envío Muestras Secuenciación) donde indicará claramente el nombre de la muestra, el vector de clonación y el tamaño del inserto, o el tamaño del producto de PCR y el programa térmico utilizado para su amplificación, y nombre, secuencia y Tm de los cebadores a emplear.

    • El Servicio dispone de los siguientes cebadores:

        M13 directo (-40):5’GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG TA 3’
        M13 directo (-27):5’CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
        M13 directo (-21):5’TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
        M13 reverso (-29):5’CAG GAA ACA GCT ATG ACC 3’
        M13 reverso (-27):5’GGA AAC AGC TAT GAC CAT 3’
        Sp6: 5’GAT TTA GGT GAC ACT ATA G 3’
        BGH reverso: 5’TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3’
        T7 directo: 5’GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT 3’
        T7 reverso: 5’GCT AGT TAT TGC TCA GCG GTG 3’


    • Se puede utilizar cualquier otro cebador sintetizado por el usuario siempre que cumpla los siguientes requisitos:

      • Longitud: 16-22 nucleótidos
      • % GC: 40-50%
      • Tm: 50-65º C.

    • El usuario debe proporcionar un volumen mínimo de 10 µL del cebador de concentración 5 µM por reacción.



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